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酶免—電擴(kuò)散測(cè)定技術(shù)
更新時(shí)間:2011-09-09 點(diǎn)擊量:1499

酶免—電擴(kuò)散測(cè)定技術(shù)

 

一,酶聯(lián)免疫電擴(kuò)散測(cè)定技術(shù)的原理

酶聯(lián)免疫電擴(kuò)散是免疫電擴(kuò)散(Immunoelectrodiffusion,簡(jiǎn)稱IED)與免疫酶技術(shù)相結(jié)合的樣新技術(shù),其原理在于通過免疫電擴(kuò)散,抗原與該抗原相應(yīng)的IgG快速形成免疫復(fù)合物,接著用酶標(biāo)記的抗IgG免疫球蛋白與免疫復(fù)合物孵育結(jié)合,然后用底物顯色。

酶聯(lián)免疫電擴(kuò)散技術(shù)增加了免疫電擴(kuò)散的靈敏度,對(duì)分析復(fù)雜的抗原反應(yīng)和不同類型的免疫球蛋白,都有作用。

二,酶聯(lián)免疫電擴(kuò)散測(cè)定技術(shù)的程序

1,  器材與設(shè)備

電泳儀(包括電泳槽);醋酸纖維薄膜(2.5cm×17cm);微升吸管;大號(hào)培養(yǎng)皿等實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿。

2,  材料與試劑

可溶性抗原溶液;該抗原相應(yīng)的兔抗血清;HRP標(biāo)記的抗兔IgG抗體,其中特異性抗體蛋白的濃度為1.25mg/ml;0.1mol/LpH8.2巴比妥緩沖液;0.2%Haemosol溶液;0.1mol/L Ph7.6Tris緩沖液;0.01mol/LpH7.2 PBS;洗滌液(85gNaCI,500ml巴比妥緩沖液,蒸餾水加至1000ml);底物與供氫體溶液(H2O2DAB4HC1)。

3,  實(shí)驗(yàn)程序

在醋酸纖維薄膜上用軟鉛筆劃好點(diǎn)樣線,每條點(diǎn)樣線距離膜邊3cm,對(duì)距11cm,在每條點(diǎn)樣線中間用軟鉛筆劃好點(diǎn)樣點(diǎn)。

0.1mol/LpH8.2巴比妥緩沖液中浸濕,滴干水,但要保持濕潤。

用微升吸管點(diǎn)樣,一點(diǎn)加抗原3ul(1ul),另一點(diǎn)加兔抗待測(cè)抗原的血清15ul(5ul),每份點(diǎn)樣的抗原濃度為0.00150ug.

電泳條件。用濕濾紙搭橋,電泳緩沖液為0.1mol/L pH8.2巴比妥緩沖液,電流強(qiáng)度為1mA/cm,電泳時(shí)間為2h,抗原端接負(fù)極。

電泳完畢,將薄膜浸入洗滌液30min,去多余的血清蛋白與游離抗原。

將薄膜浸入0.01mol/L pH 7.2PBS中,振蕩洗滌30min,取出薄膜,滴干余水。

將酶標(biāo)記抗體以150稀釋。

用稀釋的酶標(biāo)記抗體在室溫孵育2h.

0.2%Haemosol溶液中振蕩洗滌15min.

Tris緩沖液中振蕩浸洗30min.

在底物溶液中浸1min后,觀察顯色結(jié)果。

 

滬公網(wǎng)安備 31011802001677號(hào)

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